60 Über die Kristallisation von Gärungsfermenten und ihre optischen Teste 



Nukleinsäure enthält, durch irgendeine Vorbehandlung von dem Hauptteil seiner 

 Salze, setzt zur Sicherheit noch nukleinsaures Natrium hinzu und säuert mit Essig- 

 säure an, so fallen Nukleoproteide aus und zwar je nach der Azidität, bis zu der 

 angesäuert wurde, verschiedene Nukleoproteide. Bei pH 4,5 fällt das Nukleopro- 

 teid des Proteins des oxydierenden Ferments. Man kann es ohne Wirkungs verlust 

 auf der Zentrifuge waschen, es dadurch von vielen Begleitstoffen befreien und es 

 auch, was methodisch oft von Vorteil ist, schnell beliebig stark konzentrieren. 



Um das Protein aus seiner Nukleinsäureverbindung wieder in Freiheit zu setzen, 

 suspendieren wir das Nukleoproteid in wenig Wasser, lösen es durch tropfen- 

 weisen Zusatz von Natronlauge bis pH 6 und fügen Protaminsulfat hinzu. Dabei 

 fällt die Nukleinsäure als Protaminsalz aus, während das Protein in Lösung bleibt. 



Wegen der folgenden Kristallisation ist es wichtig, daß die Nukleinsäure mög- 

 lichst vollständig abgetrennt wird. Wir prüfen den Erfolg unsrer Trennungs- 

 methode optisch, indem wir die Lichtabsorption der Lösungen, die von Nuklein- 

 säure befreit werden sollen, bei 260 m/< und 280 m/i vergleichen. Proteine haben 

 ihr Maximum bei 280 m//, während das Maximum der Nukleinsäureabsorption 

 bei 260 mit liegt. 



Zur Kristallisation versetzen wir eine 10%ige Lösung des Proteins bis zur Halb- 

 sättigung mit Ammonsulfat und fügen zu der klaren Lösung 1 /2obis 1 / w ihres Vo- 

 lumens Normal-Ammoniak. Dann erscheinen bald Nadeln und nach einigen Stun- 

 den ist die Flüssigkeit zu einem Brei reiner Kristalle erstarrt. Auch in andern Fällen 

 hat sich diese Methode der Kristallisation bewährt. 



Das Protein enthält keinen Phosphor. Es verbrennt ohne Rückstand, enthält 

 also keine Metalle. Auch für dissociierende Bindung von Metallen haben sich bis- 

 her keine Anhaltspunkte ergeben. 



Die prosthetische Gruppe des Ferments ist Diphospho-Pyridinnukleotid, dessen 

 hydrierte und nicht hydrierte Formen gleich fest von dem Protein gebunden wer- 

 den. Die Gleichgewichtskonstante dieser Bindungen hat bei 25° und pH 7,5 den 

 Wert: 



Protein X Nukleotid . o « . in-; 

 Proteid 



Mole 



Liter 



Die molare Wirksamkeit in der Richtung der Gärung beträgt bei 20° und pH 

 7,4, wenn wir mit dem von Bücher mit der Streulichtmethode gefundenen Mol. 

 Gewicht 96000 rechnen: 



W m oiar = 17000 Mole Substrat/Mole Ferment ; Minuten. 



VII. Oxydationsreaktion der Gärung 



Als wir das Nikotinsäureamid und seine wasserstoffübertragende Funktion bei 

 der Gärung entdeckt hatten, war es sofort klar, und ließ es sich durch einfache Ver- 

 suche beweisen, daß die Gärungsreaktion, in der das hydrierte Nikotinsäureamid 

 seinen Wasserstoff wieder abgibt, die Hydrierung des Acetaldehyds oder der Brenz- 

 traubensäure ist: 



Dihydro-Nikotinsäureamid + Acetaldehyd == Nikotinsäureamid + Aethylalkohol 

 Dihydro-Nikotinsäureamid -j Brenztraubensäure = Nikotinsäureamid ! Milchsäure. 



