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D-( — )-Milchsäure in Chlorella 



In den entscheidenden Versuchen haben wir die Milchsäure als Zinksalz isoliert. 

 Doch kann man einfacher die D-Konfiguration der Milchsäuredehydrase der 

 Chlorella optisch demonstrieren, indem man zu einer Lösung von Pyridinnucleotid 

 (Böhringer, [u]d~ — 30°) und Chlorella-Extrakt die beiden isomeren Milchsäuren 

 gibt. Dann nimmt die Lichtabsorption bei 340 m// wesentlich nur bei Zugabe der 

 D-Milchsäure zu, da nur die D-Milchsäure zu Brenztraubensäure dehydriert wird 

 (Abb. 1). 



060 

 T 055 

 ^.0.50 



^ 0.V5 



<*j O.W 



% 0.30 

 &0.2S 



"^ 0.20 



C 0.70 

 ^ 0,05 



Abb. 1. Verhalten von D- und L-Milchsäure 

 zu Milchsäuredehydrase der Chlorella. 2,5 

 cm 3 m/20-Pyrophosphat (pH 7), 10 mg 

 Diphosphopyridin-nucleotid, 2 mg milch- 

 saures Calcium, d- oder L-Verbindung. Bei 

 ?o 0,1 cm 3 einer Ammonsulfatfraktion von 

 Chlorella-Extrakt, die zwischen 0,35 und 

 0,55 Sättigung ausfiel. 



1 2 3 



6 18 



Minuten - 



9 w 



Einen ähnlichen Versuch haben wir früher mitgeteilt 2 , aber mit Milchsäure- 

 dehydrase aus Muskeln und aus Tumoren. Damals wurde, umgekehrt wie hier, 

 nur die L-Milchsäure, nicht aber die D-Milchsäure dehydriert. 



Zum Schluß bemerken wir, daß sich bei diesen Versuchen steril gezüchtete 

 Chlorella ebenso verhielt, wie nicht steril gezüchtete. 



Versuche 



1. d-( — ^-Milchsäure aus Brenztraubensäure mit Chlorella-Extrakt . 35 mg brenztraubensaures 

 Natrium = 0,318 mMole wurden in 75 cm 3 wz/15-Natriumpyrophosphat pH 6,2 gelöst. 0,32 mMole 

 des Natriumsalzes des Dihydro-diphospho-pyridin-nucleotids (Böhringer) und 4 cm 3 Chlorella- 

 Extrakt wurden hinzugefügt. pH des Gemisches war dann 6,4, das Gesamtvolumen 79 cm 3 . Das 

 Gemisch blieb 48 Stdn. bei 0° stehen, pH war dann 6,45. Der optische Test zeigte, daß das hydrierte 

 Pyridinnucleotid fast vollständig reagiert hatte. 



„C/2/ore//a-Extrakt" : 2000 mm 3 Chlorella, suspendiert in 6 cm 3 Wasser, wurde 30 Min. bei 0° im 

 Homogenisator behandelt. Dann wurde 30 Min. hochtourig zentrifugiert. Die überstehende 

 schwach grünliche Lösung enthielt die D-Milchsäuredehydrase. Der Extrakt kann in diesem Zu- 

 stand verwendet werden; oder es kann die Ammonsulfatfraktion von 0,35 bis 0,55 Sättigung ver- 

 wendet werden, in der das Ferment in 20fachem Reinheitsgrad vorliegt. 



Die Reaktionsmischung wurde mit Schwefelsäure auf 1/1-normal angesäuert und 20 Stdn. mit 

 Äther extrahiert. Nach Zusatz von wenig Wasser wurde der Äther verdampft. Der Rückstand ent- 

 hielt 0,25 mMole Milchsäure (bestimmt mit 2,7-Dioxynaphthalin nach Feigl (Spot Tests). 0,5 

 cm 3 der zu prüfenden Lösung -|- 2 mg Dioxynaphthalin, gelöst in 2 cm 3 konz. H2SO4, 5 Min. im 

 siedenden Wasserbad erwärmt. Milchsäure gibt eine rote Färbung). 



Die extrahierte Milchsäure wurde mit Ammoniak schwach alkalisch gemacht und dann der 

 aufsteigenden Papierchromatographie in Äthanol-Wasser-Ammoniak unterworfen (80 Vol. Äthanol, 

 16 Vol. Wasser, 4 Vol. konz. Ammoniak). Das Gebiet um Rf ■■= 0,5 wurde eluiert, die Milchsäure 

 wurde aus dem mit Schwefelsäure angesäuerten Eluat 15 Stdn. ausgeäthert. Die extrahierte Säure 

 wurde mit Zinkcarbonat bei 65° in das Zinksalz übergeführt, das im Vakuum über Blaugel ge- 



