546 Weiterentwicklung der zellphysiologischen Methoden 



Gleichgewicht hfl etwa 2 sein soll. Dann sind die Konzentrationen des DPNH2 

 oder der Brenztraubensäure im Gleichgewicht durch die Beziehung gegeben 



In 7 /7 0,7 

 14 14 



\i Mol 



cm J 



wo die Zahl 14 — die methodisch wichtigste Zahl der Biochemie — der Absorp- 

 tionskoeffizient ß des DPNH2 bei 340 m\x ist. 



Die Grundlagen der Methode findet man in den folgenden Veröffentlichungen 

 unseres Instituts: 



1. Entdeckung der reduzierenden Reaktion der Milchsäuregärung 1 . 



2. Endgültige Bestimmung der Höhe der Bande des DPNH2 bei 340 m\x ß = 

 14 cm' 2 /[j.Mol, das ist der Wert, mit dem heute alle Biochemiker rechnen 2 . 



3. Erste Messung des Gleichgewichts der Reduktions-Reaktion der Milchsäure- 

 gärung und Entdeckung der Verschiebung des Gleichgewichts durch Änderung 

 der Wasserstoffionen-Konzentration 3 . 



Die Anwendung der Methode gab zunächst unbefriedigende Resultate, wenn 

 die Zellen in Serum suspendiert waren. Serum aber, notwendig als Suspensions- 

 flüssigkeit für Körperzellen, enthält wechselnde und so große Mengen Brenztrau- 

 bensäure, daß die optischen Ausschläge für eine gegebene Milchsäuremenge we- 

 sentlich verkleinert werden, wie es die Formel des Gleichgewichts verlangt. Die 

 optische Milchsäurebestimmung war also für unsere Zwecke nur dann anwendbar, 

 wenn es gelang, vor der Bestimmung die Brenztraubensäure zu entfernen. 



Die folgende Methode hat sich bewährt. Nach Enteiweißung mit Perchlorat 

 stellen wir mit Carbonat-Hydrogencarbonat 4 auf pH 9,6 ein, oxydieren dann die 

 Brenztraubensäure mit Wasserstoffperoxyd und zerstören das überschüssige 

 Wasserstoffperoxyd mit Katalase. Erst dann setzen wir das DPN zu. 



Vorschrift 



Eine Suspension von Körperzellen in Serum, z. B. von Leukozyten in Serum, wird zu Beginn 

 und am Ende einer manometrischen Stoffwechselmessung zentrifugiert, das Zentrifugat wird mit 

 1 /io Vol. 35proz. HQO-i-Lösung enteiweißt. 



0,2 cm 3 der enteiweißten Lösung, die ungefähr 0,3 [jlMoI L-Milchsäure enthalten soll. Die 

 Anfangskonzentration der Milchsäure beträgt dann 0,1 (i.Mol/cm 3 . 

 + 2,3 cm 3 Im Carbonat-Hydrogencarbonat 1 : 1, pH 9,6. 

 + 0,1 cm 3 0,05w H2O2 = 5 [i.Mol. 15 Min. stehen lassen. Dann 

 + 0,1 cm 3 = 20 y Katalase (Böhringer). 15 Minuten stehen lassen. Dann 

 + 0,2 cm 3 DPN-Lösung = 4,56 [xMol. Die Anfangskonzentration des DPN ist dann = 



1,52 [jiMol/cm 3 . 

 + 0,07 cm 3 Wasser 



2 2,97 cm 3 . Die Reaktion wird durch 0,03 cm 3 = 150y Milchsäuredehydrogenase (Böhringer) in 

 Gang gesetzt. 



War die Anfangskonzentration der Milchsäure = 0,1 u.Mol/cm 3 , so war für l cm Lichtweg bei 

 340 mjx 7 /7 = 2,06; In 7 /7 = 0,72 



c Brenztraubensäure = c DPNH 2 = 0,72:14 = 0,051 [^Mol/cm 3 . 

 Es war also die Hälfte der Milchsäure zu Brenztraubensäure oxydiert worden. 



Im allgemeinen ist eine Berechnung des DPNH2 nicht notwendig, sondern man ermittelt die- 

 jenige Menge an L-Milchsäure, die bei Zusatz zum Test den gleichen Extinktionsanstieg erzeugt 

 wie die zu bestimmende Lösung. 



