268 SCHRAMM, BRAUNITZER, ANDERER, SCHNEIDER, UHLIG [15 

 erfolgte mit Chymotrypsin, Subtilisin und einem Proteinasengemisch aus 

 Aspergillus oryzae. Das letztere bewährte sich vor allem zur Herstellung 

 kürzerer Spaltstücke. Pepsin eignet sich weniger, da das DNP-Protein im 

 sauren Bereich zu wenig löslich ist. 



Erwartungsgemäss erhielten wir drei Gruppen gelber Peptide, die entweder 

 DNP-Prolin oder e-DNP-Lysin enthielten. Die Trennung erwies sich zum 

 Teil als ausserordentlich schwierig. Wie Sanger^^ zeigte, treten bei der enzy- 

 matischen Spaltung von Polypeptiden häufig auch Pyrrolidoncarboxylpeptide 

 auf, die in Essigester leicht löslich sind und dadurch die Trennung der DNP- 

 Peptide erschweren. Die farblosen Pyrrolidoncarboxylpeptide lassen sich 

 jedoch leicht durch die Fluoreszenz-Auslöschung im UV-Licht in den 

 Chromatogrammen erkennen. Als Trennungsmethoden benützten wir: 1.) 

 Verteilungschromatographie an Kieselgursäulen, wobei wir als mobile Phase 

 hauptsächlich Essigester-Butanol-Gemische und als stationäre Pufferlösungen 

 mit verschiedenem pH verwandten. 2.) Hochspannungselektrophorese. Wir 

 arbeiteten meist bei Spannungen von 5- 10 000 V in der von MichP" ange- 

 gebenen Anordnung in einem Toluolbad, das durch Kühlung auf etwa 10°C 

 gehalten wurde. 3.) Papierchromatographie, wobei wir besonders Pyridin- 

 haltige Lösungen und reine Puffer, z.B. 2rii Natriumacetat benützten. 



Bei der Konstitutionsermittlung der erhaltenen DNP-Peptide bewährte sich 

 neben den bekannten Methoden auch das von Justisz und Ritschard^^ 

 beschriebene Verfahren, bei dem zunächst der DNP-Rest durch Hydrierung 

 zu einem Dihydrochinoxalon abgespalten wird. 



Das Restpeptid kann entweder durch Wiederholung der Operation oder 

 nach Edman weiter abgebaut werden. Ein ähnliches Verfahren wurde unab- 

 hängig von Uhlig^^ ausgearbeitet. Die Cyclisierung tritt bereits während der 

 Hydrierung in Eisessig oder in In HCl-Methanol mit Pt oder Pd ein. Bei 

 der Umsetzung des Reaktionsgemisches mit Dinitrofluorbenzol liefern die 

 Chinoxalone Bis-DNP-Derivate, die näher charakterisiert wurden. Sie sind 

 in Chloroform oder Eisessig leicht löslich und können chromatographisch 

 identifiziert werden. 



Zu Beginn unserer Untersuchungen wurde bei der Spaltung mit Chymo- 

 trypsin haltigem Trypsin ein kristallisiertes DNP-Prolylpeptid isoliert, das 

 bei der Analyse sehr konstante Werte Heferte und von dem wir annahmen, 

 dass es aus 21 Aminosäuren besteht. Mit den verbesserten Trennmethoden 

 erwies sich jedoch dieses KristaUisat als nicht einheitlich. Es gelang schliess- 

 lich, eine Reihe von DNP-Prolylpeptiden in reiner Form zu isoUeren, von 

 denen sich die meisten der Sequenz 



DNP-Pro-Ileu-Glu-(Glu,Leu4)-Glu-Leu 

 zuordnen Hessen. Daneben fanden wir aber auch ein Peptid, dem die Sequenz 



DNP-Pro-Leu-Val 



zukommt und das mit der eben angeführten Reihenfolge nicht zu verein- 

 baren ist. Beide Sequenzen wurden auch nebeneinander bei der partiellen 



