'it .0 i ii' 



■é .<>^ ür ^' ^; ^ 



16] STRUCTURE DU LYSOZYME 281 



résidus de tryptophane. On fait agir la trypsine sur le lysozyme ainsi dénaturé, 

 pendant 6 heures, à 37°, à pH 7,8, le rapport enzyme/substrat étant de 

 1/100. Une première séparation des peptides produits par la trypsine est 

 effectuée sur colonne de Dowex 50 x 2. Les détails de cette séparation et 

 les résultats qu'elle a permis d'obtenir sont indiqués dans la fig. 1.^^ 



1,0 



0,5 



3S'C 



-50°C- 



Vol. chambre de mélange : 2 t. 



,1 f..,.o.s e. 



'-0,2N;PH3.1-'-C0,2NiPH3,1^2N;PH5.1) 



T.4 



r.3 



T.6 T.7 



T.2 



0.5 1,0 1,5 2,0 2.5 3.0 3.5 5,0 

 litres > 



Fig. 1 . Séparation des produits obtenus par action de la trypsine sur 25 nM de lysozyme 

 dénaturé non oxydé. 



coloration de la réaction à la ninhydrine après hydrolyse alcaline. 



coloration de la réaction à la ninhydrine effectuée directement. 



On constate la présence de 9 seulement des 17 ou 18 pics que l'on pouvait 

 espérer obtenir. La différence correspond, comme on le verra plus loin, aux 

 peptides qui contiennent de la cystine et qui sont énergiquement retenus 

 sur la colonne. Après cette première séparation, les substances ont été 

 soumises à une série de contrôles concernant leur pureté et ont été, lorsque 

 cela s'est révélé nécessaire, purifiés par diverses méthodes: nouvelles chroma- 

 tographies sur colonne, et, après dessalification, chromatographies sur papier 

 et electrophoreses sur papier. ^^ Il a été ainsi possible d'étudier de façon 

 précise chacune des substances, ammoniac, acides aminés et peptides con- 

 stituant les pics représentés par la fig. 1. La nature des acides aminés et la 

 composition des peptides est donnée dans le tableau 4. 



En plus des acides aminés libres (leucine, lysine, arginine) et de l'ammoniac, 

 quatre peptides seulement, T.6 à T.9, ont été obtenus avec un rendement 

 supérieur à 10 %. Leur structure a été établie^" en mettant en oeuvre les 

 techniques habituelles:* détermination des acides aminés N-terminaux par 

 la méthode de Sanger et la méthode d'Edman, cette dernière étant éventuelle- 

 ment utilisée également pour l'établissement des enchaînements N-terminaux, 

 hydrolyses partielles acides ou hydrolyses chymotrypsiques fournissant des 

 peptides plus courts étudiés à leur tour d'une part à l'aide des méthodes 



* Le détail des opérations ayant permis d'établir les structures indiquées ci-dessous est 

 donné dans 19. 



