i68 c. F. coRi d al. vol. 4 (1950) 



SUMMARY 



The theory has been examined that glyceraldehyde phosphate dehydrogenase from rabbit 

 muscle contains two catalytic sites, having dissociation constants with DPN which differ by a factor 

 of 100 or more. The facts in favour of a very slightly dissociated site are that the enzyme retains 

 on recrystallization or dialysis a stoichiometric amount of DPN. From observations made in kinetic 

 measurements this DPN does not measurably dissociate on five fold dilution of the enzyme. Further- 

 more, evidence is presented that DPNH is also bound to the enzyme and that it can be displaced 

 by added DPN to an extent which indicates relative affinities of the protein for the oxidized and 

 reduced forms of at least the same order of magnitude. The fact that bound DPN can be removed 

 from the enzyme by adsorption on charcoal and that it exchanges rapidly with DPN labelled with 

 P32 allows the conclusion (a) that the binding is not of the covalent type and (b) that bound DPN 

 has a measurable dissociation. 



Other approaches to the problem did not reveal differences between the reaction with enzyme- 

 DPN and the reaction with a catalytic amount of enzyme plus added DPN. In both cases, in the 

 presence of an excess of substrate, the reaction was first order with respect to the total DPN concen- 

 tration, and the pn optimum was the same. The equilibrium constants with bound and with added 

 DPN were also the same. lodoacetate inhibited the reaction at the bound site. Kinetic studies in- 

 volving simultaneous reaction of bound and added DPN showed that with increasing concentrations 

 of the latter a saturation value was approached, but the data could not be resolved to give an une- 

 quivocal answer in terms of two catalytic sites. 



Enzyme DPNH was shown to react rapidly with lactic dehydrogenase plus pyruvate, or in the 

 reverse reaction, bound DPN was found to react with lactic dehydrogenase plus lactate. On the basis 

 of the assumption that bound DPNH has a very low dissociation, the observed rate of reaction with 

 lactic dehydrogenase would have to be attributed to collisions between protein molecules. 



In the light of available evidence the hypothesis that glyceraldehyde phosphate dehydrogenase 

 has two catalytic sites which differ in their affinity for DPN requires further examination. 



RfiSUMfi 



Un examen a ^te fait de la theorie selon laquelle la deshydrog6nase de I'aldehyde phospho- 

 glycerique du muscle de lapin possederait deux positions catalytiques dont les constantes de dissocia- 

 tion avec le DPN difif^reraient par un facteur de loo ou davantage. Les faits en faveur d'une position 

 ou la dissociation est tres faible sont que I'enzyme, lors de la recristallisation ou de la dialyse, retient 

 une quantity sto^chiometrique de DPN. D 'observations faites au cours de mesures cin^tiques, il 

 d^coule que ce DPN ne dissocie pas d'une fa9on appreciable lorsqu'on dilue I'enzyme au cinquieme. 

 En outre, des preuves sont apport^es que le DPNH est lui aussi lie a I'enzyme et peut etre deplace 

 de cette combinaison par I'addition de DPN, jusqu'a une limite qui indique que les affinites relatives 

 de la prot^ine pour la forme oxyd^e et pour la forme r^duite sont en tout cas du meme ordre de 

 grandeur. Le fait que le DPN li^ peut etre ^limind de I'enzyme par adsorption a du charbon actif, et 

 qu'il s'^tablit un ^change rapide avec du DPN marque au P^^ permet de conclure: a) que le mode de 

 liaison n'est pas du type covalent et b) que le DPN possede une dissociation mesurable. 



D'autres m^thodes d'approche du probleme pos6 n'ont pas r^vele de differences entre la reaction 

 de la combinaison enzyme-DPN et celle d'une quantite catalytique d'enzyme plus du DPN additionn^. 

 Dans les deux cas, en presence d'un exces de substratum, la reaction 6tait du premier ordre par 

 rapport a la concentration totale en DPN, et le pjj optimum 6tait le meme. Les constantes d'6quilibre 

 avec du DPN 116 ou additionn^ ^talent ^galement identiques. L'acide iodac^tique inhibe la reaction 

 au point de liaison. Des etudes cin6tiques impliquant la reaction simultan^e de DPN 116 et de DPN 

 additionn6 ont montr6 que lorsque les concentrations de ce dernier augmentent, on tend vers une 

 valeur de saturation, mais il n'a pas ete possible d'ordonner les r^sultats de fa9on a donner une 

 r^ponse non Equivoque a la question de I'existence de deux positions catalytiques. 



II a et6 montr6 que le DPNH lie r6agit rapidement avec la d6shydrog6nase lactique plus pyru- 

 vate, ou, en sens inverse, le DPN 116 avec la d6shydrog6nase lactique -f- lactate. Si Ton assume que 

 le DPNH 116 dissocie tres faiblement, la vitesse observ6e de la r6action avec la d6shydrog6nase lactique 

 devrait etre attribu6e a des collisions entre des mol6cules de prot6ine ou a la formation de complexes 

 enzymatiques organis6s. A la lumiere des faits 6tablis, I'hypothese que la d6shydrog6nase de I'alde- 

 hyde phospho-glyc6rique possede deux positions catalytiques diff6rant par leur affinit6 pour le DPN 

 demande de nouvelles 6tudes. 



ZUSAMMENFASSUNG 



Es wurde die Theorie untersucht, welche besagt dass Glycerinaldehydphosphat-Dehydrogenase 

 aus Kaninchenmuskel zwei katalytische Stellen besitzt, deren Dissoziationskonstanten mit DPN um 



References p. i6g. 



