en gebluschte kalk deed Azotobacter weder verschijnen, maar in getallen geringer dan 

 50 per cm3 bladgrond. 



Daar de meeste dezer bepalingen te Gorssel gedaan zijn gedurende den zeer dro- 

 gen zomer van 1921, zou het resultaat bij meerdere vochtigheid misschien nog kunnen 

 veranderen. Maar ik verwacht dit niet, want in de kolkjes of wielen nabij Gorssel, bij 

 vroegere doorbraken van den IJssel in zandige boschgrond gevormd, was Azotobacter 

 in den herfst van 1921 ook geheel afwezig, zoowel in het water als in de modder van 

 het midden en van de kanten. 



Daarentegen bevatte de IJsselklei, van de tamelijk vruchtbare uiterwaarden uit 

 de nabijheid, in November 1921 omstreeks \0Q Azotobacter ^gt 1 cm^. 



Naast de tellingen met behulp van de plaatmethode heb ik ook steeds parallel- 

 proeven gedaan met vloeistofkulturen als boven beschreven, dat is dus in hetzelfde 

 voedsel, dat voor de agar-platen was gebruikt maar met weglating van de agar. Of- 

 schoon hierbij gemakkelijk ook grootere hoeveelheden grond kunnen gebruikt worden 

 heb ik niet meer dan ca. 5 g per 200 cm^ vloeistof tegelijk onderzocht, om zeker te 

 zijn, dat de met den grond aangevoerde gebonden stikstof niet storend zou kunnen 

 werken. 



Daar het gebleken was, dat de aanwezigheid van Azotobacter wel is waar niet 

 noodzakelijk maar toch in hooge mate bevorderlijk is voor de ontwikkeling der anaë- 

 robe stikstofbinders in de vloeistofkulturen, heb ik bij het onderzoek der onvruchtbare 

 gronden, waarin Azotobacter ontbreekt, zoowel kuituren gemaakt zonder als met 

 kunstmatig daaraan toegevoegde stammen van Azotobacter. 



Hierbij is gebleken, dat alle onderzochte gronden, vruchtbare zoowel als onvrucht- 

 bare, onverschillig of zij uit den tuin te Delft, uit de duinen of uit de Gorsselsche bos- 

 schen of roggevelden afkomstig waren, steeds rijk zijn aan de anaërobe stikstof bin- 

 dende kiemen van de boterzuur- en de butylfermenten, dus aan het geslacht Granulo- 

 bacter, waartoe Clostridium pastorianum van Winogradsky behoort. Deze 

 kiemen zijn dus veel algemeener verspreid dan Azotobacter chroöcoccum en zij geven vol- 

 strekt geen maat voor de vruchtbaarheid van den grond. Hun algemeenheid kan in 

 verband staan met hun rijkdom aan exoenzymen, waaronder diastase, pektinase en 

 trypsine; zij kunnen zelfs leven en gisten van de substantie van Azotobacter. Daar 

 zij zeer resistente sporen voortbrengen, ontwikkelen zij zich ook in gepasteuriseerde 

 of gedurende korten tijd gekookte kuituren. Vooral in dit geval is voor hun aantoo- 

 ning infektie met reinkultuur van Azotobacter na het koken en afkoelen aan te bevelen, 

 daar de „kleine bakteriën" voor de zuurstof absorptie noodig, evenals Azotobacter, 

 door het pasteuriseeren of koken gedood worden. 



Ook voor de stikstofbinding door de anaëroben is de aanwezigheid van krijt in de 

 kultuurvloeistof gunstig, maar blijkbaar berust dit op het neutraliseeren van het uit 

 de suikers gevormde boterzuur en niet op de noodzakelijkheid van het element cal- 

 cium voor hun ontwikkeling, zooals bij Azotobacter. Dit blijkt uit de volgende proef. 



Ent men de manniethoudende kultuurvloeistof, boven beschreven, zonder toe- 

 voeging van krijt, met vruchtbaren tuingrond, dan blijkt het kalkgehalte voldoende 

 om na eenige dagen een vrij flinke Azotobacterhuid te doen ontstaan, waaronder zich 

 waterstof en koolzuur ontwikkelen door Granulobacter. Indien men echter aan deze 

 kultuurvloeistof een weinig natriumoxalaat toevoegt, voldoende om al het calcium 



