FREIE NINHYDRIN-POSITIVE STOFFE IN PHORMIA UND DROSOPHILA 5 1 1 



Phenylthioharnstoff zugegeben. Die Entfernung der Eiweisse erfolgte durch Ver- 

 setzung der Hàmolymphe mit dem 1 J^-fachen Volumen 10%iger Perchlorsàure. 

 Die Probe wurde im Eisschrank ùber Nacht stehengelassen, und dann zentrifugiert. 

 Anschliessend wurde die uberstehende Losung durch Zugabe von 50%iger Kali- 

 lauge auf pH 4 eingestellt. Nach Abkuhlung in der Kâlte wurde das ausfallende 

 Kaliumperchlorat abzentrifugiert. Schliesslich wurde die klare uberstehende 

 Losung in einem Vakuum-Rotationsverdampfer bei ca. 40° C eingedickt, und der 

 Rùckstand in destilliertem Wasser, dessen Volumen demjenigen der urspriing- 

 lichen Hàmolymphe-Probe entsprach, aufgenommen. 



Fur die Herstellung der Extrakte wurden die Larven gewogen und in einem 

 Glashomogenisator mit wenig Ringerlôsung unter Kùhlung wàhrend mehrerer 

 Minuten homogenisiert. Nach dem oben beschriebenen Verfahren wurde das 

 Homogenat enteiweisst und eingedickt. Die Konzentration der so hergestellten 

 Extrakte betrug 0,9 — 1,5 g Frischgewicht pro ml. 



Die von uns angewandte 2-dimensionale Hochspannungselektrophorese war 

 im Prinzip àhnlich wie die von Gross (1959) angegebene Méthode. Mittels einer 

 Mikropipette wurden 20 yl Hàmolymphe oder 30 — 40 fxl Extrakt auf ein Filter- 

 papier (Whatman Nr. 3 MM, 37 x 41 cm) aufgetragen. Das Papier wurde zunàchst 

 gleichmâssig mit einer 8%igen Ameisensâure-Lôsung (pH 1,5) besprùht, auf ein 

 trockenes Filterpapier gelegt und mit einer Walze vorsichtig gewalzt, um die 

 ùberschùssige Sàure zu entfernen. Wir legten dann das Papier zwischen zwei 

 Glasplatten in einen Elektrophorese- Apparat (Pherograph Modell 64, L. Hormuth, 

 Wiesloch). Die Auftrennung geschah mit einer Spannung von 1300 — 1400 V und 

 einer Stromstàrke von 100 m A, und dauerte ca. 1 1 / 2 Std. Wâhrend der Elektro- 

 phorese wurde die Temperatur im Kiihlsystem auf ca. — 5° C festgehalten. Nach 

 Beendigung der ersten Trennung und grùndlicher Entfernung der Ameisensâure 

 in einem Luftstrom bei 60° C wurde das Papier erneut mit einem Carbonat- 

 Bicarbonat-Puffer (17 g Na 2 C0 3 + 28,6 g NaHCO s + 10 1 H 2 0) von pH 9,6 

 besprùht. Die Elektrophorese in der 2. Dimension erfolgte durch Anlegen einer 

 Spannung von 2000 — 2100 V und einer Stromstàrke von 80 mA, und dauerte 

 ca. 1 54 Std. Das Papier wurde wiederum in der Wârme getrocknet. 



Um das Muster der so aufgetrennten Stoffe sichtbar zu machen, wurde das 

 Pherogramm zuerst durch eine Ninhydrinlôsung (5 g Ninhydrin + 970 ml 

 Aceton + 30 ml Essigsàure) gezogen. Dièses wurde dann wàhrend 30 Min. 

 bei 60° C erwârmt. Aile Ninhydrin-positiven Flecken wurden mit einem Bleistift 

 eingerahmt. 



Die Identifizierung der Peptide wurde nach einer urspriinglich von Rydon 

 und Smith (1952) ausgearbeiteten und von Pan und Dutcher (1956) modifizierten 

 Méthode durchgefùhrt. Im Anschluss an die Ninhydrinfârbung bespriihten wir 

 das Pherogramm mit einer 0,28%igen Natriumhypochloritlôsung. Durch die 

 Chlorierung verschwand die Ninhydrinfarbe. Nachdem das Papier in der Luft 



