RNS-SYNTHESE BEI DROSOPHILALARVEN 



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wurde Saccharose (1 g) verwendet, das Kasein (Fluka, Buchs) wurde mit 80 mg 

 Arginin, 50 mg Tryptophan und 30 mg Cystin supplementiert. Die Eier wurden 

 7 min lang mit einer 3%igen Na-Hypochlorit-Lôsung sterilisiert. Unter der vor- 

 liegenden Zuchtbedingung wird die Entwicklung etwas verlangsamt, bis zur Ver- 

 puppung benôtigen die Larven 5 anstelle von 4 Tagen. Zudem sind die Larven 

 etwas kleiner als auf Standardfutter (Mais-Hefe-Agar) aufgezogene Tiere. 



2. Markierung 



Larven des gewùnschten Stadiums (Frischgevvicht ca. 0,2 g) wurden in 

 0,5 ml einer 0,5%igen Saccharoselôsung mit 200 \l\ 32 P-Natrium-orthophosphat 

 inkubiert (1 mc/ml, 1 mg/ml, The Radiochemical Centre, Amersham). Die Inku- 

 bation erfolgte bei 25° C wàhrend 2 Stunden. 



3. Extrakîion der RNS 



Fur die Dichtegradienten-Zentrifugation wurde die Extraktion der RNS im 

 wesentlichen nach der von Scherrer und Darnell (1962) beschriebenen Méthode 

 durchgefùhrt. Die Larven (Frischgewicht ca. 0,2 g) wurden in 5 ml Lôsung I 

 (0,1 m NaAc pH 5, 0,5 % Na-Dodecylsulfat, 10 jjLg/ml Polyvinylsulfat, 500 u-g/ml 

 Bentonit, 0,001 m MgCl 2 , 0,001 m MnCl 2 , 0,1 m NaCl) in der Kâlte homogenisiert. 

 Das Homogenat wurde dann zweimal mit der gleichen Menge Phénol (80%, 0,1 % 

 Hydroxychinolin, nach Kirby (1967)) bei 4° C ausgeschùttelt. Die wàssrige Phase 

 wurde mit 1/10 Volumen 1 m NaAc versetzt, dann mit 2y 2 Volumen Âthanol bei 

 — 20° C ùber Nacht die RNS ausgefâllt. Der Niederschlag wurde in 5 ml Lôsung II 

 (0,01 m NaAc pH 5, 0,001 m MgCl 2 , 0,05 m NaCl, 2 fjig/ml Polyvinylsulfat) mit 

 50 (xg Desoxyribonuclease (DNase I, Serva, Heidelberg) bei 20° C 10 min lang 

 behandelt. Die DNase wurde anschliessend mit Phénol entfernt, und die RNS 

 durch Zugabe von 1/10 Volumen 1 m NaAc und 2j/ 2 Volumen Âthanol bei 

 — 6° C wâhrend 3 Stunden erneut ausgefâllt. Der Niederschlag wurde in Lôsung II 

 aufgenommen. 



Fur die Polyacrylamidgel-Elektrophorese erfolgte die RNS-Extraktion wie 

 oben, jedoch mit den folgenden Anderungen: Die Konzentrationen an MgCl 2 

 und MnCl 2 wurden in Lôsung I und II auf 0,0001 m erniedrigt. Anschliessend an 

 die DNase-Behandlung wurde die RNS in 1 ml Lôsung II aufgenommen und 

 2 Stunden bei 4° C gegen Lôsung II dialysiert. Nach der Fàllung mit NaAc und 

 Âthanol wurde die RNS in gleichen Mengen Puffer I und PufTer II (siehe unten) 

 aufgenommen. 



4. Dichtegradienten-Zentrifugation 



Es wurden jeweils 300 fxg RNS auf einen linearen Saccharosegradienten 

 aufgetragen (5—20%, 0,01 m NaAc pH5, 10" 4 m EDTA). Die Zentrifugation 

 erfolgte bei 0° C entweder 8j/ 2 Stunden bei 36,000 Upm oder 11 y 2 Stunden bei 



